依赖宫颈癌三阶梯筛查分流诊断方案的局限性磋商

【关键词】子宫颈癌；人类染色体端粒酶；筛查；人乳头瘤样病毒；荧光原位杂交技术；宫颈上皮内瘤变

【Abstract】Cervical cancer is the most common malignancy of the female genital tract.
Its incidence is still increasing with lower average onset age. The three-step screening, cytology-Colposcopy-histology, is recommended widely in China, still it has some shortcomings. hTERC gene test has the following meanings for cervical cancer screening: Firstly, it will be applied for cervical cancer screening, particularly for special types of cervical cancer cases. Secondly, it will assist the pathologic diagnosis of cervical lesions. Thirdly, It will give some valuable advices for diagnosis and treatment of dissatisfied CIN I-CIN II cases. Lastly, it will predict the residual or recurrence after treatment of CIN cases, and assess its prognosis.
【Key words】cervical cancer; human telomerase RNA component；screening；human papilloma virus；fluorescence in situ hybridization；cervical intraepithelial neoplasia

　　宫颈病变进而宫颈癌是一种感染性疾病,可以预防,可以治愈。从现今人类对它的认识，应该有希望成为人类第一个被控制的癌症。因为①患者因性交接触性出血可以早期察觉而就医；②使用窥阴镜、阴道镜可视，容易被医生观察得到；③方便的取到标本进行病毒、细胞及活组织检查；④病因明确，能对23+2种HPV-HD病毒作分型检测；⑤目前研制出的两价或三价HPV-HD病毒疫苗可以从15岁开始接种预防；⑥有成熟规范的超薄液基细胞涂片技术进行细胞学检测；⑦在世界范围内推广建立了统一的“三阶梯”筛查分流模式；⑧有利普刀锥切或其他较普及物理治疗技术处理早期病变。殊不知，在“三阶梯”筛查分流模式推广实施的今天，临床上也碰到了不少实际问题，如宫颈细胞学检查灵敏度、阴性预测值低，ASCUS 判断与病理学专家认识密切相关，处理棘手；HPV-DNA检测特异度、阳性预测值低；“一过性HPV感染率高”，缺乏中国人种的型别库；阴道镜检查灵敏度、阴性预测值低，设备及检查者理论及操作技术要求高；病理学检查的染色、制片、阅片水平及对TBS系统理解差异而出现的偏倚和主观性等局限性，致使临床实践中治疗不足或治疗过度的问题时有发生，如何让细胞学观察的经验医学向基因定量检测的循证医学发展，是医学家面临的新的挑战。

　　众所周知，2008年德国病毒学专家Harald zur Hausen和两位法国专家Francoise Barre Sinoussi和Luc Montagnier发现宫颈癌是由人乳头瘤样病毒（human papilloma virus,HPV）引起而获当年的诺贝尔生理医学奖。而对端粒与端粒酶的研究成为肿瘤发病机制及基因治疗热点的妇产科医生却知之甚少。2009年诺贝尔生理医学奖得主伊丽莎白布莱克本(Elizabeth Blackburn)、卡罗尔格雷德(Carol Greider)和杰克绍斯塔克(Jack Szostak)，发现了端粒和端粒酶保护染色体的机制，细胞在分裂时染色体如何完整地自我复制以及染色体如何受到保护而免于退化。连续两年诺贝尔奖在宫颈癌诊治领域中获得奖项史上少见。它使得分子生物学、分子遗传学、免疫学等相关学科迅速发展渗透到肿瘤诊治的临床医学转化研究领域。

1. 人染色体端粒酶基因（hTERC）
　　端粒酶(telomerase)是由端粒酶RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物(RNP)。研究表明，除干细胞、生殖细胞和活化的淋巴细胞外，人类端粒酶在大多数永生化细胞和各种肿瘤，如头颈部肿瘤、胃癌、前列腺癌等实体肿瘤组织中有表达，大多数正常组织中表达阴性。端粒酶的主要功能是能够以自身RNA为模板，逆转录合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生化。在通常情况下，正常细胞分裂伴随着稳定的端粒长度缩短，最终导致细胞老化和细胞分裂周期的停止。而端粒酶的上调可以维持端粒的长度，使肿瘤细胞能够突破正常的增殖限度，逃避细胞凋亡，从而导致肿瘤的发生。此外，抑制端粒酶的活性可导致肿瘤细胞的老化或凋亡，说明端粒酶活性是维持肿瘤细胞的长期生存所必需的。

　　子宫颈癌的发生是一个逐步过程，大多数子宫颈癌由CIN发展而来。除与高危型HPV感染与整合有关外，基因改变起着非常重要的作用。1989年Morin首次从人宫颈癌细胞株中检测到端粒酶活性，之后有学者采用比较基因组杂交技术(comparative genomic hybridization,CGH)对77例宫颈癌患者进行了DNA拷贝数检测，结果发现3号染色体长臂(3q)的扩增是宫颈癌中最常见的基因改变之一，约占54.5%[1]。Olaharski等[2]应用双色荧光原位杂交法检测到ASCUS、LSIL和HSIL患者的宫颈涂片，结果显示随着病变进展，非整倍体发生频率明显增加，并出现三倍体等特殊类型。由此可见，宫颈癌和宫颈高度病变常出现染色体增加、缺失、非整倍体等染色体不稳定现象，特别是3q拷贝数增加，且宫颈癌拷贝数明显高于重度不典型增生或原位癌，推测该区域可能存在宫颈癌发生的致病基因。其中，所涉及最重要的基因是人类染色体端粒酶 (human telomerase RNA component，hTERC) 基因。

　　hTERC基因位于3q26.3[3]。研究证实3q是宫颈癌基因改变的热点区域，3q的扩增常常在重度不典型增生及原位癌中出现，提示此种基因变异与高度鳞状上皮内瘤变进展为浸润性癌相关[1,4-8]。尽管大部分的肿瘤都扩增了完全的3q，但其共同区域定位于3q26～q29。通过鉴定发现位于3q26上最重要的基因可能为hTERC基因。许多研究将hTERC基因扩增作为一种生物标记物，对预测子宫肿瘤发生的进展进行评估,结果发现hTERC基因的扩增几乎在所有高度鳞状上皮内瘤变中稳定出现。提示hTERC基因的异常扩增可能是宫颈癌形成的早期事件，同时该基因可作为检测宫颈癌及其癌前病变的标志物。

2. FISH技术检测hTERC基因
　　荧光原位杂交( fluorescence in situ hybridization,FISH)技术是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一项非放射性分子细胞遗传学技术[9]。基本原理是应用荧光染料标记探针DNA，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交，在荧光显微镜下检测荧光信号来显示特定核苷酸序列的存在、定位及数目，可用于组织切片、细胞涂片及染色体制片等组织标本。目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、产前诊断等领域，尤其是遗传学性状异常但组织形态改变不典型的肿瘤诊断，已成功应用于产前诊断及部分实体肿瘤如乳腺癌、膀胱癌、胆管癌、卵巢癌等的检测。

　　最近,美国国立卫生研究院针对子宫颈癌的研究，认为FISH技术同样可以应用于子宫颈癌的检测，指出将FISH技术应用于子宫颈癌前病变筛查以及预后的监测方面有重要的临床意义。能够客观地从基因学角度检测出各级宫颈病变中不同程度的hTERC基因扩增。临床试验也表明，hTERC基因扩增与宫颈细胞及组织诊断密切相关。在细胞学上,NILM和ASCUS患者的hTERC扩增率明显低于HSIL及SCC患者。相应的组织学上,CINⅠ的患者hTERC扩增率明显低于CINⅢ或宫颈浸润癌的患者，hTERC基因的扩增率随着宫颈病变的升级而上升。

3. FISH技术检测宫颈脱落细胞中hTERC基因的应用
　　2006年12月至2009年6月卫生部医药卫生科技发展研究中心组织的课题“荧光原位杂交技术在产前遗传性疾病及部分肿瘤检测的多中心临床应用”(课题编号：WKJ2007-3-001)中子课题“荧光原位杂交技术检测子宫颈上皮细胞hTERC基因扩增的临床应用研究”，全国共83家单位参与，利用FISH技术对8443例宫颈脱落细胞标本进行hTERC基因检测。结果显示在宫颈液基细胞学结果为正常、良性细胞学改变、ASCUS、ASC-H、LSIL、HSIL细胞中，hTERC基因扩增率分别为11.33%、23.81%、35.53%、59.52%、43.96%和81.41%。其中ASCUS、ASC-H、LSIL和HSIL之间两两比较，差异均有统计学意义；hTERC基因检测对预测高级别宫颈病变的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为77.52%、71.82%、66.42%和81.63%。

　　暨南大学附属第一医院妇科宫颈癌临床研究团队参与课题单位，在临床实践中先期采用该技术检测宫颈脱落细胞中hTERC基因，得出结果表明宫颈细胞学结果为NILM、ASC、LSIL、HSIL及ICC中hTERC基因扩增率分别为10.0%、35.7%、83.3%、95.8%及100.0%。hTERC基因扩增率随宫颈病理级别的上升而增加[10]。采用液基细胞学（TCT）制片法图片清晰、细胞量充足、杂交成功率较高。FISH技术操作简便，探针标记后稳定，重复性好；其方法敏感，能迅速得到结果，24小时即可完成检测；检测结果客观，人为主观因素影响小。

4. FISH技术检测宫颈石蜡包埋切片中hTERC基因的应用
　　暨大一院妇科临床研究团队在前期实验采用宫颈脱落细胞检测hTERC基因的过程中，发现了以下问题：①采用脱落细胞制片要尽量使用新鲜样本制片，及早制片才能减少TCT保存液对染色体的破坏，这也是影响杂交率的关键；②部分液基细胞标本经TCT检测后，剩余细胞量不足，而重新取材患者的依从性差，检测结果重复性亦差；③制片时已采集所有细胞，若制片后发现细胞消化过度或细胞重叠，则失去重复检测的机会；④制片时虽可将粘液、血液去除，但宫颈炎性细胞仍严重影响杂交信号的判断；⑤宫颈脱落细胞易受生理周期及外界因素所影响。尤其是出现细胞消化不足和消化过度的现象比较常见。消化不足时，细胞膜可影响探针的渗入；而消化过度，染色体遭到破坏则影响杂交信号。

　　FISH技术的优点之一就是其适检的标本源丰富，间期细胞、分裂中期细胞；分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可受检。影响FISH技术在石蜡包埋切片组织中端粒酶检测结果有两方面因素：①石蜡切片本身的因素：如制作过程中的固定、脱水、包埋以及石蜡标本的存放年限等；②石蜡包埋切片的处理因素：包括酶的消化、杂交情况以及杂交后的洗涤等。石蜡包埋切片相对于宫颈脱落细胞的优势就在于标本能固定、贮存较长时间而不影响检测结果，但组织标本的固定是影响杂交结果的一个尤为重要的因素。课题组将宫颈脱落细胞检测hTERC基因改为利用FISH技术检测宫颈石蜡包埋切片中hTERC基因的扩增情况。结果显示，利用FISH技术检测宫颈石蜡包埋切片中hTERC基因，玻片预处理后细胞满意度为98.2%；杂交成功率为89.2%。对照组、CINⅠ、CINⅠ-Ⅱ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌组中hTERC基在扩增率分别为5.6%、10.0%、32.1%、65.7%、88.6%及95.0%。hTERC基因的扩增率随着宫颈病变程度递增而逐渐增加。在后期实验的制片过程中发现，宫颈石蜡包埋切片经处理后背景更干净，其细胞数量满意度、细胞形态、裸核数量满意度更好，荧光信号满意度以及杂交成功率均较脱落细胞检测方法高。特别是石蜡包埋切片检测在选片部位正确的基础上避免了血液、粘液的干扰，染色体破坏少，其荧光信号强，荧光信号点粗大，明亮，便于观察，结果更具客观性。

5. TERC基因检测在宫颈癌三阶梯筛查中的意义
　　许多文献都证实宫颈脱落细胞中hTERC基因检测扩增率随着宫颈病变级别的上升而逐渐增加，说明hTERC基因与宫颈癌的发生和进展有密切的联系。我们实验结果亦显示，宫颈石蜡包埋切片中hTERC基因在宫颈高级别病变及宫颈癌中扩增率明显高于宫颈低级别病变，有望作为辅助手段之一用于宫颈癌的筛查，以协助区分宫颈高级别病变与低级别病变。

　　部分地区认为只要CIN均是宫颈癌前病变，需要积极治疗。但大量资料证明，CIN未经治疗有较高的自然消退率,如此会造成对于CINⅠ级存在明显的过度治疗现象，过度治疗而使患者的宫颈功能破坏。 CINⅠ60%～90%在2年内可自然逆转[11,12],而且癌变的机率极低。但部分组织学为CINⅠ，而细胞学结果为AGC或HSIL者,则需高度警惕,要注意识别遗漏的CINⅡ/Ⅲ，应行阴道镜检查或LEEP。这种情况下，可以增加hTERC基因检测，以补充细胞学和HPV检测中不足,预测肿瘤发展的高危因素,更准确地预测疾病预后，作出合理的处理。Heselmeyer-Haddad等采用FISH三色探针检测宫颈涂片中hTERC基因的扩增情况，发现LSIL中hTERC基因扩增率占7.14%，HSIL占76.0%，hTERC基因扩增率和四倍体细胞数目随着宫颈病变的严重程度增加而逐渐上升。他们对这些病例随访1～3年后，发现在hTERC基因扩增的病例中，CINⅠ/Ⅱ进展到CINⅢ者多于hTERC基因阴性病例，hTERC基因预测CINⅠ/Ⅱ进展到CINⅢ的灵敏度为100%，特异度为70%。因此， hTERC基因检测可作为预测疾病进展和肿瘤发生的指标。

　　实验结果表明，hTERC基因检测对预测CINⅡ及以上病变具有良好的的灵敏度和特异度，其阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比及阴性似然比均较高。灵敏度明显高于细胞学检查，特异度明显高于HPV检测，阳性预测值与细胞学检查接近，阴性预测值也较其他筛查方法高。因此认为，hTERC基因检测能更好地预测并及时诊断宫颈高级别病变以期得到早期治疗。提示这项技术有可能成为细胞学检查和HPV检测的辅助手段，协助筛查出CINⅡ及以上的高级别病变和浸润癌。

　　宫颈高级别病变及宫颈癌治疗后需要严密随访。对此，2011年NCCN宫颈癌筛查临床指南中有明确规定，CINⅡ、CINⅢ或宫颈癌存在病变持续或复发高危因素者在初次治疗后需每年进行筛查至少20年。三阶梯的诊断方案对于治疗后的筛查具有一定的局限性。首先，锥切后宫颈的解剖形态已被破坏，宫颈转化区回缩入宫颈管内，给细胞取材及阴道镜评估带来困难。其次，部分患者经过化学治疗或放射治疗后，卵巢功能下降，阴道及宫颈上皮菲薄，上皮细胞数量不足以判断结果，或者出现一些反应性改变，进一步影响细胞学检查结果的灵敏度。在随访过程中，可以加上hTERC基因的检测，以及早发现病变残留或复发。

　　与宫颈鳞癌的发病情况不同，宫颈腺癌的发病率呈逐年升高趋势。Andersson [13]等利用FISH技术对12例早期宫颈腺癌石蜡包埋的宫颈组织进行hTERC基因检测，发现全部病例均存在该基因的扩增。研究同时发现，hTERC基因的扩增在HPV阳性与阴性病例中无明显差异，且与诊断年龄、疾病分期、肿瘤分化、淋巴结转移和预后随访无明显相关性。认为hTERC基因的扩增可能是宫颈腺癌本身自有的特征之一，有研究者认为在宫颈腺癌恶变过程中起主要作用的可能不是HPV，而是其他致瘤因素。推测hTERC基因可作为生物标记物对宫颈腺癌进行检测。

　　综上所述，在宫颈病变筛查及诊治分流中，hTERC基因检测可用于：①宫颈癌筛查手段之一，对“三阶梯”诊断结果进行分流；②对特殊类型宫颈癌病例的快捷检测，如妊娠期宫颈病变脱落组织的筛查；③协助病理检查确诊宫颈病变，指导对CINⅠ或阴道镜不满意的CINⅠ-Ⅱ级病例分流处理；④预测宫颈病变及宫颈癌治疗后的残留、复发或预后评估
（如图1所示）。

 
图1 推荐宫颈癌筛查方案

参考文献
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