合作单位：同济医院妇产科
细胞凋亡在宫颈癌发生发展中的变化
作者：吴丹|乔玉环|史惠蓉|孙莹璞|李爱军 单位： 来源：河南医科大学第一附属医院 编者：
摘 要：目的：探讨细胞凋亡在宫颈癌发生发展中的变化。方法：采用脱氧核苷酸转移酶介导的生物素末端缺口标记法(TdT mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)检测15例正常宫颈上皮，22例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ/Ⅱ，16例CIN Ⅲ及52例浸润性宫颈鳞癌(ISCC)组织中的细胞凋亡标记指数(A-LI)，并用免疫组化ABC法检测这些组织中增殖细胞核抗原PCNA的表达。结果：在正常宫颈上皮，CIN Ⅰ/Ⅱ,CIN Ⅲ及 ISCC中 A-LI分别为0.00±0.00，0.33±0.09，0.69±0.14和0.07±0.01；PCNA标记指数(P-LI)分别为：9.87±1.32，22.57±2.05，31.01±2.04和65.92±3.01。结论：细胞凋亡在宫颈癌恶变前的发生发展中以抑制细胞过度增殖而发挥负调控作用，在ISCC阶段其调控作用可能已经紊乱。
Changes and meanings of apoptosis during the pathogenesis and development of squamous cervical carcinoma
WU Dan,QIAO Yuhuan,SHI Huirong,SUN Yingpu，LI Aijun
(Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract：Aim：To study the action of apoptosis during the pathogenesis and development of squamous cervical carcinoma.Methods:By using TdT mediated dUTP-biotin nick and labeling method(TUNEL)to detect the apoptotic labeling indices(A-LI)in 15 cases of normal cervical epithelia,22 cases of cervical intraepithelia neoplasia (CIN)Ⅰ/Ⅱ,16 cases of CIN Ⅲand 52 cases of invasive squamous cervical carcinoma (ISCC)tissues,and using immunohistochemical ABC method to detect the expressions of PCNA(proliferating cell nuclear antigen)in the tissues above mentioned.Results:In normal cervical epithelia,CIN Ⅰ/Ⅱ,CIN Ⅲ and ISCC,A-LI were 0.00±0.00,0.33±0.09,0.69±0.14 and 0.07±0.01 respectively;P-LI(PCNA-LI) were 9.87±1.32,22.57±2.05,31.01±2.04 and 65.90±3.01 respectively.Conclusion:Apoptosis plays a negative regulating action by inhibiting excessive proliferation of cell during the developing course of squamous cervical carcinoma premalignancy,and the regulation might have been inordinate in ISCC.
Key words：apoptosis;cervical intraepthelia neoplasia;squamous cervical carcinoma▲
细胞凋亡(Apoptosis)和有丝分裂相辅相成，在肿瘤发生发展中发挥着重要作用，宫颈癌的发生和发展呈一典型的渐进性过程。研究细胞凋亡在宫颈癌发生发展中的变化及作用，将揭示宫颈癌发生发展的内在机制，为临床防治奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 选取本院1995～1997年宫颈癌病理活检及手术切除组织蜡块。其中浸润性宫颈鳞癌(ISCC)52例；宫颈上皮内瘤变(CIN)38例，其中CIN Ⅰ/Ⅱ 22例，CIN Ⅲ 16例；正常宫颈组织15例。患者年龄18～77岁，平均(49±9.6)岁，取活检及手术前患者均未行放疗及化疗。细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德公司，增殖细胞核抗原(PCNA)抗体、免疫组化ABC试剂盒及DAB底物试剂盒均来自美国Vector公司(北京中山生物工程公司分装)。
1.2 方法
1.2.1 凋亡细胞原位末端标记法：切片常规脱蜡至水；体积分数为3％ H2O2处理5 min；TBS(pH 7.5)稀释的蛋白酶K室温消化5 min；蒸馏水冲洗；加标记缓冲液1 min后甩掉；取TdT和DIG-dUTP各1 μl，加入8 μl标记缓冲液中，混匀加至标本片上，37℃标记1～2 h；TBS冲洗；封闭液封闭20 min；加用封闭液稀释的Anti-DIG-Biotin,37℃反应30 min；TBS冲洗；加SABC室温30 min;TBS冲洗；DAB显色，苏木素复染，分化，脱水，中性树胶封片。以已知凋亡细胞阳性的乳腺癌切片为阳性对照，在反应中省略TdT作阴性对照。
1.2.2 PCNA：应用免疫组化ABC技术，PCNA与PBS缓冲液的体积比为1∶100。
1.3 观测指标 凋亡细胞(含凋亡小体)阳性细胞为细胞核出现棕黄色颗粒。在低倍视野下(100×)选取切片平整，细胞分布均匀的视野，再在高倍镜下(400×)记数1 000个细胞中的阳性数，每例记数10个视野，以阳性细胞百分数表示即标记指数(LI)。分别记数细胞凋亡标记指数(A-LI)和增殖细胞核抗原标记指数(P-LI)。
1.4 统计学处理 采用t检验。
2 结果
在正常宫颈未检测到凋亡细胞，CIN Ⅰ/Ⅱ可在基底层检测到少量的凋亡细胞，从CINⅠ/Ⅱ到CIN Ⅲ，A-LI逐渐增高(P<0.05)，A-LI和CIN的损害程度呈正相关，ISCC中A-LI明显低于CIN Ⅲ组(P<0.05)。在宫颈各级病变中，PCNA表达均为阳性，从正常上皮到CIN到癌，PCNA标记指数(P-LI)逐渐增高(P<0.05)，在ISCC时增加更加显著(P<0.01)，P-LI明显随宫颈癌的发生发展而增高，见表1。
表1 细胞凋亡和PCNA在宫颈各级病变中的表达(
) 病理学类型
n
P-LI
A-LI
正常宫颈上皮
15
9.87±1.32
0.00±0.00
CIN Ⅰ/Ⅱ
22
22.57±2.05▲
0.33±0.09
CIN Ⅲ
16
31.01±2.04*
0.69±0.14*
ISCC
52
65.92±3.01＃
0.07±0.01△
与CIN Ⅰ/Ⅱ比较：*P<0.01；与CINⅢ比较：＃P<0.01，△P<0.05；与正常宫颈上皮比较：▲P<0.05
3 讨论
目前，关于细胞凋亡在肿瘤的发生发展中的作用有两种观点：一种是细胞凋亡可能作为机体抑制细胞过度生长的一种自稳机制而抑制肿瘤的发生发展；另一种观点是细胞凋亡可能通过筛除一些不易癌变的细胞，使那些有癌变倾向的细胞更具侵袭力。
作者发现在正常宫颈上皮，有一低水平的增殖，没有观察到凋亡细胞，这种结果可能与某些抑凋亡基因，如bcl-2[1]在此期的高表达有关。CINⅠ/Ⅱ可在基底层检测到少量凋亡细胞，从CINⅠ/Ⅱ到CIN Ⅲ，P-LI逐渐增高，A-LI也逐渐增高；从CIN Ⅲ到ISCC，P-LI继续增高，这与宫颈癌的多步发生学说相符合[2]，而A-LI在ISCC阶段明显减少，提示机体以细胞凋亡方式平衡细胞增殖的能力减弱，细胞凋亡和细胞增殖之间的协调作用已经紊乱。Isacson等[3]和Shoji等[4]发现从正常宫颈上皮→CINⅠ→CIN Ⅱ→CIN Ⅲ→浸润癌，A-LI和P-LI均呈增高趋势，而Sheets等[5]却发现完全相反的结果：A-LI随着P-LI的增高而逐渐降低，在ISCC凋亡细胞几乎检测不到。随着CIN的进展，上皮基底层不典型增生细胞增多，具有不典型增生特征的细胞对凋亡调控信号的敏感性增强。因此，作者认为，在宫颈癌发生发展中，细胞凋亡主要通过抑制不典型增生细胞的过度增殖而使肿瘤的恶变时间延长，当细胞凋亡不能平衡不典型增生细胞的增殖时，肿瘤即发生恶性变，说明细胞凋亡是肿瘤抵抗恶性转化的关键防御机制。
参考文献：
[1]Hamsel BT,Smedtst F,Kuypers J,et al.Bcl-2 immunoreactivity increase with severity of CIN:a study of normal cervical epithelia,CIN and cervical carcinoma.J Pathol,1996,179:26
[2]Shim DM,Voravud N,Ro JY,et al.Sequential increases in proliferating cell nuclear antigen expression in head and neck tumorigenesis:a potential biomarker.J Natl Cancer Inst,1993,85:971
[3]Isacson C,Kessis TD,Hedrick L,et al.Both cell proliferation and apoptosis increase with lesion grade in cervical neoplasia but do not correlate with human papillomavirus type.Cancer Res,1996,56:669
[4]Shoji Y,Saegusa M,Takano Y,et al.Correlation of apoptosis with tumor cell differentiation,progression,and HPV infection in cervical carcinoma.J Clin Pathol,1996,49:134
[5]Sheets EE,Crum CP,Yeh J.Association between cervical neoplasia and apoptosis as detected by in situ nuclear labeling.Gynecol Oncol,1996,63:94
Changes and meanings of apoptosis during the pathogenesis and development of squamous cervical carcinoma
WU Dan,QIAO Yuhuan,SHI Huirong,SUN Yingpu，LI Aijun
(Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract：Aim：To study the action of apoptosis during the pathogenesis and development of squamous cervical carcinoma.Methods:By using TdT mediated dUTP-biotin nick and labeling method(TUNEL)to detect the apoptotic labeling indices(A-LI)in 15 cases of normal cervical epithelia,22 cases of cervical intraepithelia neoplasia (CIN)Ⅰ/Ⅱ,16 cases of CIN Ⅲand 52 cases of invasive squamous cervical carcinoma (ISCC)tissues,and using immunohistochemical ABC method to detect the expressions of PCNA(proliferating cell nuclear antigen)in the tissues above mentioned.Results:In normal cervical epithelia,CIN Ⅰ/Ⅱ,CIN Ⅲ and ISCC,A-LI were 0.00±0.00,0.33±0.09,0.69±0.14 and 0.07±0.01 respectively;P-LI(PCNA-LI) were 9.87±1.32,22.57±2.05,31.01±2.04 and 65.90±3.01 respectively.Conclusion:Apoptosis plays a negative regulating action by inhibiting excessive proliferation of cell during the developing course of squamous cervical carcinoma premalignancy,and the regulation might have been inordinate in ISCC.
Key words：apoptosis;cervical intraepthelia neoplasia;squamous cervical carcinoma▲
细胞凋亡(Apoptosis)和有丝分裂相辅相成，在肿瘤发生发展中发挥着重要作用，宫颈癌的发生和发展呈一典型的渐进性过程。研究细胞凋亡在宫颈癌发生发展中的变化及作用，将揭示宫颈癌发生发展的内在机制，为临床防治奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 选取本院1995～1997年宫颈癌病理活检及手术切除组织蜡块。其中浸润性宫颈鳞癌(ISCC)52例；宫颈上皮内瘤变(CIN)38例，其中CIN Ⅰ/Ⅱ 22例，CIN Ⅲ 16例；正常宫颈组织15例。患者年龄18～77岁，平均(49±9.6)岁，取活检及手术前患者均未行放疗及化疗。细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德公司，增殖细胞核抗原(PCNA)抗体、免疫组化ABC试剂盒及DAB底物试剂盒均来自美国Vector公司(北京中山生物工程公司分装)。
1.2 方法
1.2.1 凋亡细胞原位末端标记法：切片常规脱蜡至水；体积分数为3％ H2O2处理5 min；TBS(pH 7.5)稀释的蛋白酶K室温消化5 min；蒸馏水冲洗；加标记缓冲液1 min后甩掉；取TdT和DIG-dUTP各1 μl，加入8 μl标记缓冲液中，混匀加至标本片上，37℃标记1～2 h；TBS冲洗；封闭液封闭20 min；加用封闭液稀释的Anti-DIG-Biotin,37℃反应30 min；TBS冲洗；加SABC室温30 min;TBS冲洗；DAB显色，苏木素复染，分化，脱水，中性树胶封片。以已知凋亡细胞阳性的乳腺癌切片为阳性对照，在反应中省略TdT作阴性对照。
1.2.2 PCNA：应用免疫组化ABC技术，PCNA与PBS缓冲液的体积比为1∶100。
1.3 观测指标 凋亡细胞(含凋亡小体)阳性细胞为细胞核出现棕黄色颗粒。在低倍视野下(100×)选取切片平整，细胞分布均匀的视野，再在高倍镜下(400×)记数1 000个细胞中的阳性数，每例记数10个视野，以阳性细胞百分数表示即标记指数(LI)。分别记数细胞凋亡标记指数(A-LI)和增殖细胞核抗原标记指数(P-LI)。
1.4 统计学处理 采用t检验。
2 结果
在正常宫颈未检测到凋亡细胞，CIN Ⅰ/Ⅱ可在基底层检测到少量的凋亡细胞，从CINⅠ/Ⅱ到CIN Ⅲ，A-LI逐渐增高(P<0.05)，A-LI和CIN的损害程度呈正相关，ISCC中A-LI明显低于CIN Ⅲ组(P<0.05)。在宫颈各级病变中，PCNA表达均为阳性，从正常上皮到CIN到癌，PCNA标记指数(P-LI)逐渐增高(P<0.05)，在ISCC时增加更加显著(P<0.01)，P-LI明显随宫颈癌的发生发展而增高，见表1。
表1 细胞凋亡和PCNA在宫颈各级病变中的表达(
) 病理学类型n
P-LI
A-LI
正常宫颈上皮
15
9.87±1.32
0.00±0.00
CIN Ⅰ/Ⅱ
22
22.57±2.05▲
0.33±0.09
CIN Ⅲ
16
31.01±2.04*
0.69±0.14*
ISCC
52
65.92±3.01＃
0.07±0.01△
与CIN Ⅰ/Ⅱ比较：*P<0.01；与CINⅢ比较：＃P<0.01，△P<0.05；与正常宫颈上皮比较：▲P<0.05
3 讨论
目前，关于细胞凋亡在肿瘤的发生发展中的作用有两种观点：一种是细胞凋亡可能作为机体抑制细胞过度生长的一种自稳机制而抑制肿瘤的发生发展；另一种观点是细胞凋亡可能通过筛除一些不易癌变的细胞，使那些有癌变倾向的细胞更具侵袭力。
作者发现在正常宫颈上皮，有一低水平的增殖，没有观察到凋亡细胞，这种结果可能与某些抑凋亡基因，如bcl-2[1]在此期的高表达有关。CINⅠ/Ⅱ可在基底层检测到少量凋亡细胞，从CINⅠ/Ⅱ到CIN Ⅲ，P-LI逐渐增高，A-LI也逐渐增高；从CIN Ⅲ到ISCC，P-LI继续增高，这与宫颈癌的多步发生学说相符合[2]，而A-LI在ISCC阶段明显减少，提示机体以细胞凋亡方式平衡细胞增殖的能力减弱，细胞凋亡和细胞增殖之间的协调作用已经紊乱。Isacson等[3]和Shoji等[4]发现从正常宫颈上皮→CINⅠ→CIN Ⅱ→CIN Ⅲ→浸润癌，A-LI和P-LI均呈增高趋势，而Sheets等[5]却发现完全相反的结果：A-LI随着P-LI的增高而逐渐降低，在ISCC凋亡细胞几乎检测不到。随着CIN的进展，上皮基底层不典型增生细胞增多，具有不典型增生特征的细胞对凋亡调控信号的敏感性增强。因此，作者认为，在宫颈癌发生发展中，细胞凋亡主要通过抑制不典型增生细胞的过度增殖而使肿瘤的恶变时间延长，当细胞凋亡不能平衡不典型增生细胞的增殖时，肿瘤即发生恶性变，说明细胞凋亡是肿瘤抵抗恶性转化的关键防御机制。
参考文献：
[1]Hamsel BT,Smedtst F,Kuypers J,et al.Bcl-2 immunoreactivity increase with severity of CIN:a study of normal cervical epithelia,CIN and cervical carcinoma.J Pathol,1996,179:26
[2]Shim DM,Voravud N,Ro JY,et al.Sequential increases in proliferating cell nuclear antigen expression in head and neck tumorigenesis:a potential biomarker.J Natl Cancer Inst,1993,85:971
[3]Isacson C,Kessis TD,Hedrick L,et al.Both cell proliferation and apoptosis increase with lesion grade in cervical neoplasia but do not correlate with human papillomavirus type.Cancer Res,1996,56:669
[4]Shoji Y,Saegusa M,Takano Y,et al.Correlation of apoptosis with tumor cell differentiation,progression,and HPV infection in cervical carcinoma.J Clin Pathol,1996,49:134
[5]Sheets EE,Crum CP,Yeh J.Association between cervical neoplasia and apoptosis as detected by in situ nuclear labeling.Gynecol Oncol,1996,63:94
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