雌激素与三苯氧胺对子宫内膜癌细胞bcl-2 mRNA水平的调节
【摘要】 目的 探讨雌激素与三苯氧胺对子宫内膜癌bcl-2癌基因的调节机理。方法 采用逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)法，检测子宫内膜癌细胞雌激素受体(ER)阳性RL-952细胞中bcl-2 mRNA表达水平，及其与雌激素和三苯氧胺作用后的变化。结果 ER阳性RL-952细胞有bcl-2 mRNA表达。经10-12、10-10、10-8、10-7 mol/L 17-β-雌二醇(E2)与RL-952细胞作用72小时后，bcl-2与β-actin mRNA的比值分别为6.94±0.03、7.15±0.02、7.47±0.01、8.44±0.01，呈逐渐升高趋势；经10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L三苯氧胺与RL-952细胞作用72小时后，bcl-2与β-actin mRNA的比值分别为3.62±0.03、2.87±0.01、2.23±0.01、1.98±0.02，呈逐渐下降趋势。结论 雌激素可通过促进bcl-2的表达，抑制细胞凋亡，在ER阳性的子宫内膜癌发病中起了一定作用；三苯氧胺则降低bcl-2的表达水平，促进细胞凋亡，可能产生治疗子宫内膜癌的效应。
【关键词】 子宫内膜肿瘤 癌基因，bcl-2 雌激素类 他莫昔芬
子宫内膜癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤，内源性或外源性雌激素的长期刺激，是子宫内膜癌发病的重要原因。但是雌激素刺激腺上皮生长以致癌变的分子生物学机理仍不清楚。本研究采用体外实验的方法，研究雌激素与三苯氧胺对子宫内膜癌细胞株bcl-2癌基因的调节，以探讨子宫内膜癌发生的机理。
材料与方法
一、细胞株与试剂
1. 子宫内膜癌细胞株：子宫内膜癌细胞株雌激素受体（ER）阳性(+) RL-952细胞由上海医科大学妇产科医院提供，其胞浆及胞核ER(+)。
2. 试剂：17-β-雌二醇(E2)和三苯氧胺等为美国Sigma公司产品，RNA抽提试剂盒购自美国Promega公司，bcl-2引物及β-actin引物由上海植物生理研究所研制。
二、方法
1. 细胞培养与RNA抽提：ER(+)RL-952细胞按常规方法培养于RPMI-1640培养液中(含15％小牛血清)，0.25％胰蛋白酶消化传代，分成等量接种入50ml培养瓶中，分为对照组和实验组，接种48小时后，更换培养液。实验组加入17-β-E2或三苯氧胺，使其终浓度分别为10-12、10-10、10-8、10-7mol/L或10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L，对照组及实验组每一剂量接种细胞各3瓶，置于5％二氧化碳培养箱(37℃)培育72小时后，按Promega公司试剂盒要求进行RNA抽提。
2. 逆转录(RT)反应：将待测RNA3μl，寡dT 1 μl，无RNA酶去离子水12μl依次加入eppen-dorf(Ep)管中，70℃反应5分钟，再加入5×逆转录酶缓冲液5μl，dNTP混合物(10mmol/L)2μl，RNA酶抑制剂(40U/ μl) 1μl，M-MLV逆转录酶(200 U/ μl) 1μl，42℃反应1小时，95℃灭活逆转录酶5分钟，0～5℃放置5分钟，-20℃短暂冻存。
3. 聚合酶链反应(PCR)：在Ep管中依次加入10×PCR反应缓冲液5μl， MgCl2(25mmol/L) 3μl ，dNTP混合物(10mmol/L) 1μl，bcl-2(20μmol/L)上、下游引物各1μl，β-actin (20μmol/L)上、下游引物各1μl，Tag聚合酶(5U/μl)0.2μl， cDNA模板2μl，加无菌双蒸水至总反应体积50μl。加1滴石蜡油后移至PCR扩增仪行PCR扩增。95℃ 45秒，65℃ 45秒，72℃ 2分钟，循环35次，72℃ 7分钟，4℃保存。扩增产物在2％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上电泳，以PCR相对分子质量标准为参照物，置紫外灯下，通过密度扫描成像仪进行DNA条带光量子强度分析。
三、统计学处理
本研究数据以平均数±标准差(±s)表示，采用EPI INFO统计软件对数据进行方差分析及相关分析。
结果
一、 RL-952细胞RNA RT-PCR扩增产物
17-β-E2 和三苯氧胺作用后，RL-952细胞RNA RT-PCR扩增产物见图1，2。bcl-2 mRNA的RT-PCR产物为385bp，β-actin为198bp。
M：相对分子质量标准 1：10-12(单位：mol/L，
下同) 2：10-10 3：10-8 4：10-7
图1 17-β-E2作用后RL-952细胞RNA RT－PCR扩增产物
M：相对分子质量标准 1：10-8(单位：mol/L，下同)
2：10-7 3：10-6 4：10-5
图2 三苯氧胺作用后RL-952细胞RNA RT－PCR扩增产物
二、 17-β-E2作用后RL-952细胞中bcl-2 mRNA
17-β-E2作用后，RL-952细胞bcl-2 mRNA有一定的表达，经10-12、10-10、10-8、10-7 mol/L 17-β-E2作用72小时后，其bcl-2与β-actin mRNA的比值分别为6.94±0.03、7.15±0.02、7.47±0.01和8.44±0.01，呈逐渐升高的趋势，与对照组(6.44±0.01)相比,差异有极显著意义(P<0.01)。经相关分析，RL-952细胞bcl-2与β-actin mRNA的比值与17-β-E水平的对数值呈正相关（γ＝0.93），两者比较，差异有显著意义(P<0.05)。
三、三苯氧胺作用后RL-952细胞中bcl-2 mRNA表达水平
RL-952细胞与10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L三苯氧胺作用72小时后，其 bcl-2与β-actin mRNA的比值分别为3.62±0.03、2.87±0.01、2.32±0.01、1.98±0.02，与对照组(6.44±0.01)相比，呈逐渐下降的趋势，两者比较，差异有非常显著意义(P<0.01)。经相关分析，RL-952细胞 bcl-2与β-actin mRNA的比值与三苯氧胺浓度的对数值呈负相关（r＝0.90），两者比较，差异有显著意义(P<0.05)。
讨论
bcl-2癌基因是与细胞凋亡关系极为密切的基因之一，它可通过抵抗多种方式的细胞死亡，延长细胞的寿命，使细胞数目累积增多而促进肿瘤形成［1］。有学者应用免疫组化法，在子宫内膜癌和乳腺癌中检测出bcl-2的存在，并发现其表达水平与ER和孕激素受体（PR）相关［2,3］。有关雌激素与bcl-2关系的研究发现，ER(+)的乳腺癌细胞株中，雌激素能促进bcl-2 mRNA及其蛋白表达，而在ER(-)的乳腺癌细胞株中则无此作用［4-6］。
一、雌激素对RL-952细胞bcl-2 mRNA的调节作用
本研究采用RT-PCR法，以β-actin为内源性参照物，对子宫内膜癌细胞中bcl-2 mRNA进行了半定量分析。其中bcl-2与β-actin引物序列特异性高，无交叉反应，而且可在同一管中同时扩增两个不同长度的片段，从而使因反应条件不同而引起的误差减小到最低程度，结果稳定、可靠，与有关文献报道一致［4,5］。本研究结果表明，随着17-β-E2浓度的增加，RL-952细胞bcl-2 mRNA水平升高，呈剂量依赖反应，提示雌激素能促进bcl-2的表达（即上调作用）。而对ER(-)的子宫内膜癌细胞株的研究发现，雌激素不能促进其增殖［7］。可见雌激素与ER相结合是其发挥作用的一个重要条件。现已发现，bcl-2基因增强子上含有某些与雌激素受体蛋白结合序列一致的SP1-结合位点［8］，推测雌激素可能在转录水平直接调节bcl-2 mRNA的表达，从而抑制细胞凋亡，在ER(+)的子宫内膜癌的发生、发展中起了一定的作用。
二、三苯氧胺对癌细胞bcl-2 mRNA的调节作用
三苯氧胺为三苯乙烯属物质，是一种非甾体类的抗雌激素药物。以往的研究表明，三苯氧胺及其类似物与雌激素相互作用可降低ER(+)MCF-7乳腺癌细胞bcl-2 mRNA及其蛋白的表达水平。此外，三苯氧胺对ER(+)的子宫内膜癌和喉癌细胞株，都可产生抑制作用，认为它是通过拮抗雌激素而起作用的［4,9］。近年来发现，三苯氧胺及其类似物还能诱导细胞凋亡，但其机理尚未明确。我们将三苯氧胺直接作用于RL-952细胞，结果三苯氧胺降低了bcl-2 mRNA表达水平（即下调作用），在子宫内膜癌、乳腺癌实验中已发现，三苯氧胺可增加细胞转录生长因子TGF-β-1水平，减少成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子的表达。这些内源性因子的增加或减少，与bcl-2间的相互作用与细胞凋亡有关［10-12］。由于bcl-2癌基因能抑制或阻断细胞凋亡，延长细胞生存期，而三苯氧胺能下调ER(+)子宫内膜癌细胞bcl-2 mRNA水平，可能给三苯氧胺的治疗效应提供理论依据。这一点还需进一步研究。
参考文献
1 Reed JC. bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol,1994,124:1-6.
2 Leek KD,Kaklamanis L,Rezzella F,et al. bcl-2 in normal human breast and carcinoma,association with oestro
相关文章 
